SOLVAYPHARMA Ukraine. Солвей Фарма.

A. M. Палаш, Г. С. Дж. Чиперс, В. де Рехт, П. ван Эвийк, M. Бэлджет, Р. Брэндс,

Фармацевтические лаборатории Солвей., Висп, Нидерланды

Ключевые слова: грипп, клеточная культура, вакцина, MDCK, безопасность,

гуморальный иммунный ответ.

Введение

Для контроля над распространением гриппа очень важно в достаточном количестве располагать противогриппозной вакциной. В случае резкого увеличения спроса на вакцины, например, при возникновении эпидемий или пандемий гриппа, современная технология производства вакцин из оплодотворенных куриных яиц может стать сдерживающим фактором.

Существуют и другие технологии производства вакцин, в которых не используются куриные эмбрионы, например, метод клеточных культур. Возможно, такие технологии помогут резко увеличивать производство вакцин в случае острой потребности. Поэтому эксперты Всемирной Организации Здравоохранения указывают на необходимость разработки метода клеточных культур для производства противогриппозных вакцин (1). С этой целью нами была разработана методика получения субъединичной вакцины из культуры эпителиальных клеток МDCK (2-4).

В данной статье мы суммируем результаты клинических испытаний, проведенных в 1995-96 годах с использованием инактивированной субъединичной противогриппозной вакцины, выделенной из MDCK-клеток. Основная цель данных исследований состояла в том, чтобы показать, что данная вакцина удовлетворяет критериям Европейского серологического общества (СРМР), требующего ежегодной регистрации противогриппозных вакцин в государствах-членах Европейского Сообщества (5). Другой нашей задачей было продемонстрировать, что вакцина, полученная из клеточной культуры по своим иммуногенным и реактогенным свойствам сравнима с классической вакциной, полученной из куриных эмбрионов. Проведенные клинические испытания показали, что технология получения вакцин из MDCK-клеток отлично подходит для удовлетворения внезапно возникающих потребностей в противогриппозных вакцинах (1).

Материалы и методы

Хранение клеток, тесты на безопасность и производство вакцин

Результаты тестов на безопасность линий MDCK-клеток были описаны ранее (2-4) и будут освещены в данной статье (Ред. Brands R и др.).

Методы исследования

В данной работе представлены результаты девяти клинических испытаний, в том числе рандомизированных, проведенных по двойному слепому методу, в качестве контроля использовалась вакцина из куриных эмбрионов. Все исследования проводились в соответствии с Европейским руководством по проведению клинических испытаний (GCP) (6). До начала испытаний было получено одобрение комитета по этике; каждый участник дал письменное согласие на участие в эксперименте.

Два испытания было проведено с бивалентной вакциной (15 µг НА на штамм); остальные исследования проводились с использованием тривалентных вакцин, соответствующих рекомендациям ВОЗ (7-9). До вакцинации (полной дозы) и через три недели после нее брались образцы крови и мочи для определения индукции антител сыворотки, стандартной биохимии, анализа крови и мочи.

Чтобы оценить местную и общую реакцию организма и степень неприятных ощущений в первые 72 часа после вакцинации использовалась стандартная анкета. Кроме того, руководители эксперимента просили участников отмечать любое клиническое проявление в первые три недели после вакцинации независимо от степени выраженности и от того, имеет ли оно отношение к прививке или нет.

В целях предосторожности в некоторых исследованиях пациентам перед проведением полноценной иммунизации вводили низкие дозы вакцины (1:10). В ряде других испытаний через три недели после проведения первой иммунизации проводилась повторная иммунизация. Через три недели после проведения каждой вакцинации брался повторный образец крови для лабораторного анализа и определения титра HI-антител.

Отдельные исследования проводились с пациентами, страдающими повышенной чувствительностью к куриному белку и с представителями группы риска - теми, кто плохо перенес предыдущую иммунизацию стандартной вакциной из куриных эмбрионов (FluvirinR). Эти данные не включались в общий мета-анализ, представленный в данной статье, а были описаны отдельно.

Лабораторные анализы

Титры антител, выработанных против компонентов вакцины, измеренные до и после вакцинации в сыворотке крови были измерены с помощью стандартных анализов ингибирования гемагглютинации (haemagglutination inhibition - HI), описанных Palmer et al (10) с использованием турецких эритроцитов (Национальный Институт биологических стандартов и контроля, Великобритания (J.M. Wood) и Национального Центра по исследованию Гриппа, Нидерланды (A.D.M.E. Osterhaus). Штаммы вакцин для HI-анализов были культивированы либо в клетках куриных эмбрионов, либо в MDCK-клетках. Для исследования брались результаты анализов сыворотки крови лиц, иммунизированных вакциной из MDCK-клеток и измеренных с помощью антигенов к MDCK-клеткам. Отрицательный результат анализа сыворотки (титр < 10) считался равным 5, а титры > 2560 считались равными 2560. Средняя геометрическая величина двойного определения титра использовалась для последующих расчетов. Определение стандартной биохимии, анализ крови и мочи проводились по обычным лабораторным методикам.

Статистика

Определялись следующие серологические параметры: "средний геометрический титр" (СГТ) и "средний прирост" (СП) (непрерывные переменные), а также "доля лиц, у которых послепрививочный титр антител был > 40" и "сероконверсия или увеличение титра < 4" (биномиальные переменные). Для оценки безопасности и реактогенности вакцин анализировалась частота возникновения местных и общих реакций и любых неблагоприятных факторов.

Для характеристики вакцины, полученной из MDCK-клеток в соответствии с серологическими СРМР-критериями (5) и для построения профиля безопасности объединялись результаты всех испытаний. Для сравнения действия вакцин из MDCK-клеток и вакцин из клеток куриных эмбрионов использовалось их отношение (непрерывные переменные) и отношение разности или скорость различий (биномиальные переменные). Эти параметры объединялись для всех испытаний путем построения смешанной линейной модели, где испытание*вакцина выступало в роли рандомизированного компонента, а центры внутри испытаний и вакцин - фиксированного эффекта (SAS PROC MIXED). Отношения разности или скорости различий объединялись для всех испытаний с использованием методики мета-анализа, предложенной Der-Simonian и Laird для биномиальных данных (11). Серологические результаты после проведения вакцинации (первой) также использовались для мета-анализа.

Перед началом испытаний было принято считать клинически значимой: разницу > 15% между вакцинами для каждого из исследуемых антигенов, между частотой проявления местных или общих реакций, между пропорциями лиц с послепрививочным титром HI-антител > 40. При выборе этого критерия брались в расчет как клинические заключения, так и вариация серологических данных отдельных испытаний (12-15).

Результаты

Исследование популяций

Всего в испытаниях принимали участие 1485 человек, прошедших иммунизацию вакцинами, полученными как из MDCK-клеток (759), так и из куриных эмбрионов (726). Один участник получил низкую дозу вакцины и поэтому его данные не были включены в мета-анализ. В таблице 1 представлены демографические данные о составе популяций.

Большая часть испытаний проводилась с людьми либо моложе 60, либо старше 60 лет. Как видно из таблицы вакцина из MDCK-клеток была испытана в группе, гетерогенной по возрасту, полу, состоянию здоровья участников и наличию предшествующих вакцинаций.

Таблица 1. Демографические данные: состав популяций.

			Пол		Возраст		Предшествующие вакцинации			Состояние
испытание	Вакцина	N	Муж.	Жен.	Диапазон	Средний	Да	Нет	Нет данных	здоровья
Все	MDCK курин. всего	759 726 1485	340 324 664	419 402 821	18-103 18-102 18-103	59,5 60,9 60,2	309 333 642	226 179 405	224 214 438
1	MDCK курин. всего	57 57 114	23 17 40	34 40 74	18-57 19-53 18-57	28,0 28,3 28,2	0 0 0	57 57 114	0 0 0	Здоровые
2	MDCK курин. всего	61 60 121	31 28 59	30 32 62	60-74 60-84 60-84	65,6 67,5 66,6	0 0 0	0 0 0	61 60 121	Здоровые
3	MDCK курин. всего	331 325 656	149 145 294	182 180 362	19-103 23-102 19-103	70,8 70,7 70,8	133 146 279	46 38 74	152 141 293	предрасп. к гриппу
4	MDCK курин. всего	60 60 120	33 27 60	27 33 60	19-57 18-60 18-60	26,8 27,5 27,1	0 0 0	60 60 120	0 0 0	Здоровые
5	MDCK курин. всего	60 60 120	29 36 65	31 24 55	60-83 60-83 60-83	69,5 68,8 69,1	53 56 109	7 4 11	0 0 0	Здоровые
6	MDCK курин. всего	43 15 58	12 8 20	31 7 38	20-58 18-40 18-58	29,9 28,7 29,6	4 3 7	39 12 51	0 0 0	атопические субъекты.
7	MDCK курин. всего	39 37 76	14 10 24	25 27 52	19-58 21-54 19-58	29,0 29,5 29,2	39 37 76	0 0 0	0 0 0	Здоровые
8	MDCK курин. всего	38 45 83	19 32 51	19 13 32	34-79 36-86 34-86	60,7 62,0 61,4	38 45 83	0 0 0	0 0 0	предрасп. к гриппу
9	MDCK курин. всего	70 67 137	30 21 51	40 46 86	60-95 61-99 60-99	80,2 82,0 81,1	42 46 88	17 8 25	11 13 24	предрасп. к гриппу

В двух испытаниях (№ 7 и 8), испытуемые уже прошли вакцинацию год назад и в этот раз были иммунизированы теми же вакцинами.

В таблице № 2 представлены данные о составе вакцин, использованных в разных испытаниях.

Серология

В таблицах 3 и 4 показаны зарегистрированные величины и 95%-ные доверительные интервалы серологических параметров в отдельных испытаниях и объединенные результаты для каждой из двух возрастных категорий. Наблюдаемая вариация между отдельными испытаниями согласуется с имеющимися серологическими данными для вакцин, полученных из куриных эмбрионов (12-15). В каждом эксперименте и в каждой возрастной группе соблюдались все серологические критерии, необходимые для ежегодной регистрации инактивированных противогриппозных вакцин в государствах-членах Европейского Сообщества (5).

Таблица 2. Состав вакцин.

¹Были использованы два сходных по составу антигенов штамма (5) (вакцина из MDCK-клеток: А/Вухан/359/95(Н3N2) и вакцина из куриных эмбрионов: А/Нанчанг/933/95(Н3N2)).

Таблица 3. Серологические переменные, отвечающие Европейским СРМР-критериям для участников от 18 до 60 лет (вакцина из MDCK-клеток).

Таблица 4. Серологические переменные, отвечающие Европейским СРМР-критериям для участников старше 60 лет (вакцина из MDCK-клеток).

Как ожидалось из предыдущих серологических исследований, проведенных с вакцинами, полученными из куриных эмбрионов (16), серологические результаты разных испытаний различаются. В целом, мета-анализ выявил статистически незначимое отношение MDCK/курин. вакцин после вакцинации < 1 для тестируемых (под)типов и для каждого (под)типа, 95%-ный доверительный интервал отношений включал 1.

Что касается доли лиц, чей послеиммунизационный титр антител был > 40, то было обнаружено статистически незначимое различие в отношениях разностей. Для всех трех (под)типов скорости различий были меньше 5% и их 95%-ные доверительные интервалы были меньше 15%, установленного нами предварительно порога значений клинически значимых отличий. Обнаруженная вариация и различия между отдельными испытаниями хорошо согласуются с контрольными клиническими испытаниями вакцины из куриных эмбрионов (16).

Так как значения серологических параметров могут зависеть от возраста и от наличия предыдущих вакцинаций (12,17), конечные результаты были пересчитаны после коррекции этих переменных. Эта процедура не привела к различным заключениям: все объединенные оценки эффекта остаются статистически незначимыми для всех трех (под)типов вирусов.

Безопасность и толерантность: местные и общие реакции

На рис. 1 представлена частота возникновения местных и общих реакций и степень неприятных ощущений для всех пациентов после иммунизации обеими типами вакцин (приведены суммарные данные по всем исследованиям). Как было показано ранее (14) наиболее часто встречающимся из всех местных и общих симптомов является "боль при нажатии" (25%) и "головная боль" (15%). Все другие местные и общие симптомы встречаются с частотой менее 10%. Значительные неприятные ощущения после обоих видов вакцин возникали реже, чем в 5% случаев.

Из результатов следует, что вакцины из MDCK-клеток и из куриных эмбрионов обладают сходной реактогенностью как в отдельных испытаниях, так и в целом. Суммарные отношения разности между вакцинами в том, что касается "боли при нажатии" и "головной боли" были меньше 5%, а 95%-ные доверительные интервалы отношений разности не превышали 15% - предварительно установленного порогового значения для клинически значимой разницы.

Аналогичные выводы были сделаны в отношении "любой местной реакции" и "любой общей реакции" (не показано). Частота возникновения местных и общих реакций зависела от возраста и пола (не показано), что соответствует полученным ранее данным (18). Когда суммарные результаты были скорректированы с учетом этих факторов, то общие выводы не изменились.

Рисунок 1. Частота проявления местных и общих реакций на обе вакцины в течение 72 часов после иммунизации.

Другие неблагоприятные клинические проявления, наблюдаемые в течение 3 недель после вакцинации, встречались с одинаковой частотой при применении каждой вакцины. Степень выраженности этих проявлений различалась от простой зубной боли до угрожающей жизни "сердечной недостаточности". Руководители эксперимента оценивали тяжесть этих факторов как легкую, умеренную или тяжелую. Распределение неблагоприятных проявлений по данным категориям во всех испытаниях было примерно одинаковым. Отмечено только 17 случаев "тяжелых" проявлений. Семь из них было зарегистрировано в группе, иммунизированной вакциной из MDCK-клеток, и десять - в группе, иммунизированной вакциной, полученной из куриных эмбрионов. В табл. 5 представлены те неблагоприятные проявления, которые, по мнению руководителей эксперимента, могут быть связаны с вакцинацией.

За время периода наблюдений умерло 7 участников эксперимента. Все они были пожилыми людьми (77-89 лет) и имели фоновые хронические заболевания, что повышало риск развития осложнений после гриппа. Четверо из них были иммунизированы вакциной из MDCK-клеток, трое - вакциной из куриных эмбрионов. Основываясь на критической оценке клинических симптомов, приведших к смерти, лечащие врачи и руководители эксперимента заключили, что ни один из смертных случаев не явился следствием вакцинации.

Безопасность и толерантность - физический осмотр и данные лабораторных анализов

До вакцинации и через три недели после нее был проведен общий физический осмотр пациентов и стандартные лабораторные анализы. Тщательная обработка всех данных не выявила клинически значимых результатов в каждой группе. Иными словами, никаких различий между группами обнаружено не было.

Специальные исследования: Кинетика антител

В двух испытаниях (№ 1 и 2) брались образцы крови на 3, 12, 26 и 52 неделе после вакцинации для измерения концентрации антител и построения кривой содержания антител в течение года после иммунизации каждым типом вакцин. Титр антител колебался между 53% и 61% после использования вакцины из MDCK-клеток и между 46% и 68% - после использования вакцины из куриных эмбрионов для двух типов тестируемых антигенов и двух возрастных категорий.

Специальные исследования: Вакцинация пациентов с атопической конституцией

Одно сравнительное испытание (№ 6) было проведено с пациентами, обладающими атопической конституцией. В ходе испытания была установлена одинаково хорошая переносимость обеих вакцин. После применения вакцины из куриных эмбрионов был отмечен один случай аллергической реакции. Это испытание вошло в мета-анализ, описанный в данной статье.

Таблица 5. Неблагоприятные проявления: список проявлений, по мнению руководителей эксперимента, могущих быть следствием проведенной вакцинации.

Специальные исследования: Иммунизация пациентов, страдающих повышенной чувствительностью к белку куриного яйца вакциной из MDCK-клеток

Двенадцать пациентов, обладающих повышенной чувствительностью к белку куриного яйца, были привиты вакциной из MDCK-клеток. Семь пациентов были иммунизированы по предписанию их лечащих врачей. У восьми участников не было отмечено никаких неблагоприятных последствий вакцинации. У одного человека наблюдалась клинически выраженная аллергическая реакция сразу после вакцинации (диспноэ), и в течение нескольких дней сохранялась повышенная чувствительность кожи. Степень выраженности неприятных проявлений после вакцинации оценивались им как "умеренная". У другого участника эксперимента в течение трех дней после вакцинации отсутствовала чувствительность в руке. Он оценил степень неприятных ощущений как "слабую". У двух человек наблюдалась аллергическая реакция и высыпание через соответственно 15 и 16 дней после вакцинации. Неприятные проявления отсутствовали. Т.к. между вакцинацией и появлением данных симптомов был относительно долгий промежуток, связь между ними была признана сомнительной.

Специальные исследования: Вспомогательная вакцинация пациентов, давших слабый иммунный ответ на предыдущую вакцинацию

Сорок восемь участников эксперимента, чей иммунный ответ на иммунизацию коммерческой вакциной из куриных эмбрионов (флувирин^R) был недостаточно выражен, проходили вспомогательную иммунизацию вакциной из MDCK-клеток (24) или вакциной из куриных эмбрионов (24). Обе вспомогательные вакцинации были в равной степени хорошо перенесены, но в соответствии с предыдущими исследованиями (19), ревакцинация обеими типами вакцин не повышала тот первоначальный гуморальный иммунный ответ, который наблюдался после первой вакцинации.

Данные, представленные в этой статье, свидетельствуют о том, что инактивированная субъединичная противогриппозная вакцина, полученная из MDCK-клеток отвечает серологическим СРМР-критериям, которые необходимы для ежегодного лицензирования препарата в странах-членах Европейского Сообщества (5). Кроме того, было обнаружено, что вакцина из MDCK-клеток по своим иммуногенным и реактогенным свойствам сходна с противогриппозным "золотым стандартом" - вакциной, полученной из куриных эмбрионов. Вакцина из MDCK-клеток обладает аналогичным кинетическим профилем, что и вакцина из куриных эмбрионов и также хорошо переносится атопическими субъектами. Пациенты, страдающие повышенной чувствительностью к белку куриных яиц, могут быть привиты вакциной из MDCK-клеток, но пока мы не располагаем всей необходимой информацией по данному вопросу, в целях предосторожности, следует держать таких пациентов под наблюдением врача в течение как минимум 30 минут после иммунизации.

На основании данных о безопасности, переносимости и иммуногенности и в ответ на насущную потребность развития методик получения вакцин из клеточных культур (1) для контроля над развитием гриппа в особых обстоятельствах, таких как пандемии, мы можем утверждать, что полученная нами инактивированная субъединичная противогриппозная вакцина из MDCK-клеток вполне удовлетворяет всем необходимым требованиям.

В проведении испытаний, описанных в данной статье, принимали участие следующие исследователи:

Проф. Б. Шарпентье (Франция), д-р Дж. Даун (Великобритания), д-р П. Марацци (Великобритания), д-р А.Д. Вэйд (Великобритания), д-р Д.М. Жеран (Бельгия), д-р А. Зикамп (Германия), д-р Дж. Беннет (Великобритания), проф. Дж.С. Оксфорд (Великобритания), проф. Г. Дж. Лихтгарт (Нидерланды), проф. П. Леофонт (Франция), д-р Р. де Амарал-Маркес (Португалия), д-р Р. де Мело Пато (Португалия), д-р Д.А. Хьюворт (Великобритания), д-р Дж. Г. А. Левин (Великобританя), д-р С.Дж. Пар-Бурман (Великобритания), д-р А. Сабба (Франция), д-р Д.М. Флеминг (Великобритания).

Благодарим за участие следующие клинические исследовательские организации: Иннофарм, Париж (д-р Ж. Нури) и Чилтерн, Великобритания (д-р Дж. Гунавардена).

Благодарим д-ра Дж. М. Вуда (NIBSC, Великобритания) и профессора А.Д.М.Е. Остерхауза (Национальный центр гриппа, Нидерланды) за анализ образцов сыворотки.

Выражаем большую признательность за плодотворное сотрудничество доктору В.Е.П. Байеру в проведении мета-анализа и за помощь в написании данной статьи. И, наконец, если бы добровольцы не дали бы свое согласие на участие в испытаниях, мы не могли бы их провести. Сердечно благодарим их за участие в эксперименте.

Иммунология и вакцины: Публикации

Мета-анализ клинических испытаний